實時熒光定量PCR儀的主要組成部分及其功能詳解

更新時間：2025-08-26

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　　實時熒光定量PCR儀是分子生物學中一種強大的工具，其用于定量檢測特定DNA或RNA分子的擴增過程的技術。實時熒光定量PCR儀則是執(zhí)行這一技術的平臺，它通過增加一個熒光信號采集系統(tǒng)和計算機分析處理系統(tǒng)，實現(xiàn)了對PCR擴增過程的實時監(jiān)控。在擴增時，引物利用同位素或熒光素進行標記，與熒光探針和模板特異性結合進行擴增。擴增信號通過實時采集系統(tǒng)輸送到計算機進行分析處理，最終得出量化的實時結果。

　　實時熒光定量PCR儀其核心組成部分相互協(xié)作，共同實現(xiàn)核酸的擴增、檢測與數(shù)據(jù)分析。以下是qPCR儀的主要組成部分及其功能詳解：

　　一、熱循環(huán)系統(tǒng)（Thermal Cycler）

　　熱循環(huán)系統(tǒng)是qPCR儀的核心模塊，負責精確控制PCR反應的溫度變化，實現(xiàn)DNA的變性、退火和延伸三個關鍵步驟。

　　溫度控制模塊

　　半導體加熱/制冷片：通過帕爾貼效應快速升降溫，實現(xiàn)溫度的精確控制（通常精度達±0.1℃）。

　　溫度傳感器：實時監(jiān)測反應模塊的溫度，反饋至控制系統(tǒng)以調整加熱/制冷功率。

　　熱蓋：防止反應管頂部冷凝，避免蒸發(fā)導致的體積變化和信號干擾。

　　反應模塊設計

　　樣品槽：通常為96孔板、384孔板或單管/8聯(lián)管格式，適配不同實驗規(guī)模。

　　均勻加熱：通過優(yōu)化熱傳導設計（如金屬塊或硅基材料），確保所有樣品孔溫度一致，減少邊緣效應。

　　二、光學檢測系統(tǒng)（Optical Detection System）

　　光學檢測系統(tǒng)負責實時捕獲PCR反應中的熒光信號，并將其轉化為數(shù)字信號供后續(xù)分析。

　　激發(fā)光源

　　LED或激光：提供特定波長的激發(fā)光（如488nm用于FAM染料，550nm用于HEX/VIC染料），激發(fā)熒光基團。

　　多波長設計：支持多種熒光染料（如SYBR Green、ROX、Cy5）的同步檢測，實現(xiàn)多靶標分析。

　　熒光信號采集

　　光學濾光片：分離激發(fā)光和發(fā)射光，減少背景噪聲。

　　光電倍增管（PMT）或CCD相機：高靈敏度檢測熒光信號，支持單孔或整板掃描。

　　光路設計：采用光纖傳導或共聚焦光學系統(tǒng)，提高信號采集效率。

　　檢測模式

　　終點法檢測：在PCR反應結束后測量熒光信號，適用于定性分析。

　　實時動態(tài)監(jiān)測：在每個循環(huán)的延伸階段末采集信號，生成擴增曲線，用于定量分析。

　　三、控制系統(tǒng)與軟件（Control System&Software）

　　控制系統(tǒng)與軟件是qPCR儀的“大腦”，負責協(xié)調硬件運行、數(shù)據(jù)采集與分析。

　　硬件控制

　　微處理器：執(zhí)行溫度控制程序、光學檢測指令及數(shù)據(jù)傳輸。

　　用戶界面：觸摸屏或電腦軟件，支持實驗參數(shù)設置（如溫度、時間、循環(huán)數(shù)）、運行監(jiān)控及結果導出。

　　數(shù)據(jù)分析軟件

　　基線校正：自動扣除背景熒光，修正基線漂移。

　　閾值設定：根據(jù)噪聲水平確定熒光閾值，計算Ct值（循環(huán)閾值）。

　　定量分析：通過標準曲線法或比較Ct法（ΔΔCt法）計算靶基因的初始拷貝數(shù)。

　　熔解曲線分析：針對SYBR Green等染料，通過監(jiān)測熔解溫度（Tm）區(qū)分特異性產物與非特異性產物。

　　多報告基因分析：支持多通道熒光信號的同步分析，實現(xiàn)基因表達多維度比較。

　　四、反應體系與耗材（Reaction System&Consumables）

　　反應體系與耗材是qPCR實驗的物質基礎，直接影響實驗結果。

　　反應體系組成

　　模板DNA/RNA：待擴增的核酸樣本。

　　引物（Primers）：特異性結合靶序列的寡核苷酸，定義擴增區(qū)域。

　　探針（Probes）：如TaqMan探針，攜帶熒光報告基團和淬滅基團，實現(xiàn)實時信號檢測。

　　熒光染料：如SYBR Green，非特異性結合雙鏈DNA，適用于未知序列擴增。

　　酶制劑：耐熱DNA聚合酶（如Taq酶）、逆轉錄酶（用于RT-qPCR）。

　　緩沖液與dNTPs：維持反應環(huán)境穩(wěn)定，提供原料。

　　耗材選擇

　　反應管：低吸附、耐高溫的聚丙烯管，減少核酸損失。

　　光學膜：密封反應管，防止蒸發(fā)同時允許熒光透射。

　　標準品：已知濃度的核酸樣本，用于繪制標準曲線。

　　五、輔助模塊（Auxiliary Modules）

　　部分qPCR儀配備輔助模塊，以擴展功能或提升用戶體驗。

　　梯度PCR功能

　　通過獨立控制不同區(qū)域的溫度，實現(xiàn)退火溫度的梯度設置，優(yōu)化引物設計。

　　自動化進樣系統(tǒng)

　　集成機械臂或液體處理工作站，實現(xiàn)高通量樣本的自動加載與反應體系構建。

　　遠程監(jiān)控與云平臺

　　支持實驗數(shù)據(jù)云端存儲與共享，便于多中心協(xié)作與長期追蹤。